— Ram Gen
Embrio Transfer
Embriotransfer
Embrio TERMINOLOGIJA
Embriotransfer je procedura gde se veći broj embriona (oplođenih jajnih ćelija) iz visokovredne majke (donora embriona) presadjuju u manje vredne jedinke (recipijenti embriona). Recipijent dovršava bremenitost i jagnji potomke visoke genetske vrednosti. Donor se vraća u normalni polni ciklus gde se može prirodno spariti ili ponovno uključiti u program ET za 6-8 nedelja. Zahvaljujući ET povećava se broj potomaka koja jedna visokovredna ovca može u toku svog života proizvesti. Čak i do 15 embriona se može prikupiti jednim ispiranjem, mada se tipičan broj dobijenih embriona kreće od 5 do 10. U toku jedne godine na ovaj način jedna ovca može dati preko 30 potomaka. Embriotransfer kao tehnika zauzima sve veću popularnost kod malih preživara u svetu.
Embrio Transfer
Zahvaljujući napretku tehnike, prikupljanje embriona je efikasna i minimalno invazivna tehnika, koja omogućava višekratnu proizvodnju embriona od istog davaoca. U tu svrhu mogu se koristiti i grla koja bi se zbog drugih razloga isključila iz reprodukcije, npr. upale vimena, hromosti, starosti…
Optimalan broj za pokretanje procedure ET je da se urade 3-5 majki donora i 6 ovaca po donoru.
— 01
Opšte informacije
Donorske ovce treba da imaju dobru telesnu kondiciju, da ne šepaju i trebalo bi da su idealno dobro odgojene. Donorske ovce moraju biti programirane sa hormonskim injekcijama, koje stimulišu jajnike da proizvedu više folikula, a samim tim i više jajašaca (oocita). Ovca se prirodno ili laparoskopski osemene. Embrioni se hirurški uzimaju nakon 5 dana od osemenjavanja. Embrioni se ocenjuju, nakon prikupljanja, a oni nepodobni za transfer se identifikuju i uništavaju.
Embriotransfer može da se obavi na farmi ako je farma sa većim brojem životinja. Inače bi trebalo raditi u centru za VO. Davaoci i primaoci za embriotransfer treba da budu pažljivo praćeni u cilju optimalnih rezultata. Donorske ovce se mogu ponovo programirati za dalji flašing ili prirodno parenje nakon 7-8 nedelja.
Uspešnost presadjivanja embriona se kreće od 40% – 70%. Embriotransfer je imao odlučujuću ulogu kod uvoza evropskih rasa u prekookeanske zemlje (Australija, Novi Zeland, SAD, Kanada, Južna Afrika), kao i u obrnutom smeru.
Embriotransferom se kod ovaca poboljšava genetski potencijal stada, omogućava uvećanje genetski bitnih majčinskih linija, omogućava sačuvanje vrednog i retkog genetskog materijala. Embrioni su prioritetan metod uvoza grla (pogotovo iz prekookeanskih zemalja) jer je rizik po unos bolesti znatno manji ukoliko potiču od testiranih grla i isprani prema međunarodnim standardima i može se koristiti za iskorenjivanje bolesti unutar stada.
Ženska gameta kod sisara se zove jaje ili jajna ćelija. Oocit je termin koji se koristi za ovuliranu žensku gamet. Nakon oplodnje, oocita postaje jednoćelijski embrion ili zigot. Embrion se zatim deli na dve ćelije, četiri ćelije, itd, u fazama.
Na fazi 16-ćelija, embrion postaje morula (latinski naziv za dud). Kada se formiraju šupljine (blastocele) između ćelija embriona, ona se naziva blastocista. Prve tri podele embriona naziva se rascepne podele, tako da jedna do osam ćelija embriona su definisani kao rascepna faza. Tokom ovog perioda embrion zapravo smanjuje težinu. Samo u fazi morule embrion počinje da dobija na težini.
U fazi morule, ćelije embriona će promeniti oblik. Ovaj fenomen se naziva zbijanje/grupisanje. Tokom grupisanja, postoje specijalizovani spojevi formi između ćelija, tako da ćelije mogu da komuniciraju jedna sa drugom. Kompaktnost je odličan znak da se embrion normalno razvija.
Kad se morula razvija u blastocist, formira šupljinu (blastocele) trošeći energiju da pumpa tečnost između ćelija. Takva blastocistna formacija takodje je pokazatelj kontinuiranog normalnog embrionalnog razvoja.
— 02
Embrio transfer (ET) ovaca i koza
Višestruke ovulacije i transfer embriona nudi nekoliko prednosti u odnosu na prirodni uzgoj. Jedna od najvećih prednosti je što omogućava dobijanje višestrukog potomstva u datoj godini. Veštačkom oplodnjom (VO) akcenat je stavljen na korišćenje genetski superiornih ovnova u cilju poboljšanja genetskog napretka jedinke i kroz broj dobijenih potomaka od takvih ovnova. Embriotransferom elitne ovce učestvuju sa 50% u genetskom sastavu svih potomaka čime ispiranje embriona postaje najefikasniji način za korišćenje kako genetski superiornih ovnova i ovaca za proizvodnju genetski superiornog potomstva tako i za povećanje broja potomaka, pogotovo kod ovaca.
Opis procesa
- Intravaginalni progesterosnki sunđeri se uvode u ovacu donora gde ostaju 12 – 14 dana. • Pre uklanjanja sunđera, ovce donori dobiće 6 – 8 injekcija preparata, FSH hormonima (folikul stimulišući hormon) tokom 3 – 4 dana. FSH u kombinaciji sa SŽK (serumu ždrebne kobile ili konjski horionski gonadotropin) podstiče aktivnost folikula i u odgovarajućoj fazi reproduktivnog ciklusa oslobađanje većeg broja jajnih ćelija, što se može postići u 60 – 90% donorskih životinja (tzv. multipla-ovulacija). • Oplodnja oocita postiže se laparoskopskim intrauterinim osemenjavanjem sa kvalitetnom, sveže razredjenom spermom tokom pika estrusa ili prirodnim pripustom ovna. • Ispiranje embriona se vrši 5 ½ do 6. dana posle osemenjavanja, hirurški, pod opštom anestezijom. Rogovi materice se laparotomijom vade van trbušne duplje radi ispiranja šupljine tela i rogova materice. Koriste se braunile i Folijev kateter. Embrioni se ispiraju od vrha (blizu jajovoda) na dole.
- Embrioni se sakupljaju i čuvaju u posebnim medijima tokom celog procesa. Uz pomoć jednog stereomikroskopa, embrioni se izdvajaju van medija i klasifikuju po kvalitetu I, II (prenosivi embrioni) i III kvaliteta, koji nisu pogodni za transfer.
- Stepen odgovora na hormone zavisi od broja odgovarajućih malih folikula već prisutnih u jajnicima. Njihov broj može u velikoj meri varirati od ovce do ovce – otud i varijabilnost dobijenih odgovora. Previše folikula često mogu dovesti do loše ovulacije i slabe ili nikakve oplodnje. Neke ovce i neke rase su posebno osetljive na hormone i zahtevaju prilagodjavanje doze da bi se postigli zadovoljavajući rezultati.
- Ovce primaoci se sinhronizuju sa ovcama donorima da bi odgovarale po vremenu ovulacije-direktan transfer svežih embriona. • Alternativa je da se zamrznu i čuvaju embrioni u tečnom azotu da bi se kasnije preneli ili izvozili. • Koncepcija sveže prenetim embrionima je bolja (65 – 90%) nego sa zamrznutim embrionima (40 – 55%).
— 03
Praktična primena prenosa embriona - ET
- Brzo i efikasno genetsko unapredjenje stada. Sa odgovarajućom evidencijom stada, odgajivač identifikuje najbolje ovace u svom stadu pomoću VO i ET tehnika, broj potomaka iz tih dokazanih ovaca može se višestruko povećati u kratkom vremenskom periodu. • Izvoz genetskog materijala. Određene rase koza i ovaca, naročito Dorper, su u velikoj potražnji i već se nalazi u mnogim zemljama. Embrioni se izvoze po posebnim dozvolama za uvoz iz drugih zemalja.
- Povećanje broja uvezenih rasa ovaca ili koza. Zbog ograničenog broja uvoza treba da se koriste ove tehnike da bi se uvećalo potomstvo. Čak i sa ograničenim brojem životinja, samo sa boljom negom i intenzivnom primenom ovih tehnika, omogućeno je brzo umnožavanje željene rase ovaca ili koza. • Embrion se smatra najsigurnijim načinom prenosa genetskog materijala širom sveta. Donorske životinje su testirane pre i posle prikupljanja embriona na virusne i bakterijske bolesti koje mogu biti kritične. Embrioni prolaze kroz intenzivni sistem ispiranja pre zamrzavanja i zapečaćeni su u slamčici.
— 04
Ograničenja kod VO i ET
- Cena: To je prilično skupa tehnika i jedino odgovara odgajivačima priplodnih grla. • Iskustvo operatera: Samo stručnjaci sa dobrim iskustvom u ovoj oblasti mogu da ga obavljaju. • Visok nivo upravljanja: Dobro vodjenje evidencije, kontrola i ishrana su obavezni kako bi se napravio uspeh u ovim tehnikama. • Broj ispiranja: Ovca se mogu isprati nekoliko puta, ali postoji ograničenje zbog mogućih komplikacija hirurškim intervencijama (ožiljci, priraslice materice).
— 05
Stvari koje treba imati na umu
- Ne postoji način da se utvrdi da li će donor ovca pozitivno reagovati na program super-ovulacije ili ne. Ovce sa prethodnim zapisom redovnog jagnjenja i dobrog majčinskog instinkta imaju prednost. • Ovce donori i primaoci (recipijenti) moraju biti u pozitivnoj fazi rasta (telesni prirast) u vreme osemenjavanja i ispiranja embriona i/ili presađivanja embriona. • Životinje sa ocenom telesne kondicije između 2,5 i 3 su najidealnije. Životinje koje su iznad ili ispod navedene telesne kondicije mogu negativno reagovati na hormonsku pripremu. • Izaberite ovna donora i ovcu sa najboljim genetskim predispozicijama u (za) vašem stadu. • Donorski ovnovi moraju biti veoma plodni, sa dobrim kvalitetom semena. • Donor , kao i primalac ovca ne smeju biti sjagnjeni. • Potrebno je tretirati sve ovce antiparaziticima širokog spektra, kao i multivitaminskim preparatima najmanje pet nedelja pre osemenjavanja. • VO i ET nije jeftin, ali trenutne cene priplodnih grla kao i genetski napredak apsolutno govore u prilog isplativosti ovih procedura.
— 06
Zaključak
Ove tehnike pružaju dragocene mogućnosti za modernizaciju uzgoja stada ovaca i može se primeniti u praksi sa uspehom. Višestruke ovulacije, transfer embriona i veštačko osemenjavanje predstavljaju najbrži način da se vrhunska genetika umnoži u Vašem stadu. Ukoliko odgajivač imaju viziju pravca u kome želi da razvija svoje stado, ove tehnike potpomognute reprodukcije može pružiti ogroman profit u proizvodnji.
ISPIRANjE EMBRIONA NA FARMI I PROGRAMI TRANSFERA EMBRIONA
Izvođenje uspešnog ET programa “na farmi” sa zadovoljavajućim rezultatima je moguće, ali je neophodan veoma dobar sistem upravljanja.
— 07
Planiranje
Program treba da se planira 6 – 8 nedelja pre transfera, čak i duže ukoliko ovce-primaoci embriona moraju da budu kupljeni. Tokom ovog vremena, potrebno je rešiti nekoliko stvari:
- pravilna ishrana donora i primaoca embriona; označavanje i rukovanje donorima i primaocima embriona; organizovati kontrolu semena/ovnove– ovaj zadatak nemojte odlagati do poslednjeg časa; kontaktirati izvršioce osemenjavanja iz Centra kako bi se blagovremeno i u potpunosti informisali o planovima i postupku pripreme za osemenjavanje; organizujte objekte – objekti treba da budu pod krovom i zaštićen od promaje;
- 4 – 5 nedelja pre očekivanog datuma operacije, program rada će Vam biti prosledjen zajedno sa odgovarajućim lekovima, hormonima, itd. Ovaj program će biti skiciran na dnevnom nivou u pravacu dogadjaja namenjenih da se postigne uspešan rezultat. Sve stavke moraju biti pažljivo, blagovremeno i u potpunosti sprovedene. Svako odstupanje od programa mora biti prijavljeno.
— 08
Potrebni objekti
Za sprovođenje osemenjavanja, ispiranja embriona i presađivanje embriona nisu potrebni specijalni objekti. Dovoljan je jednostavan nadkriven prostor koji može da štiti od vremenskih nepogoda (vetar, kiša, sneg i sunce). Nakon početka sprovodjenja hormonalnog programa ne može se menjati dan izvršenja programa u slučaju lošeg vremena. Zbog toga je potrebno obezbediti bilo kakav smeštaj za ove potrebe. Takodje, objekat mora da ima izvor električne energije. U slučaju jake zime mora se obezbediti topla prostorija kako ne bi došlo do tzv. “hladnog šoka” embriona i njihovog uginuća.
— 09
Postupci na dan kolekcije embriona
Kolekcija embriona se normalno obavlja 6. dana posle oplodnje (osemenjavanja ili pripusta). Ispiranje je procedura koja može da potraje 20-30 minuta. Prikupljena tečnost isprane materice mikroskopski se pregleda i prikupljeni embrioni se prebacuju u posebnu tečnost za čuvanje embriona. Procedura pretraživanja može da potraje neko vreme, jer su embrioni veoma mali i često ih je teško naći u sluzi i detritusu koji je obično prisutan u ispirku. Embrioni se pregledaju, ispituju i klasiraju po kvalitetu. Nakon toga embrioni se ili pakuju u slamčice za prenos u druge ovce, ili zamrzavaju ili se odbacuju ukoliko nisu za transfer.
— 10
Ovce primaoci embriona i embrio transfera (ET)
Ispravna i odgovarajuća selekcija i upravljanje primaocima je od vitalnog značaja za uspeh programa ET. Upravljanje primaocima od prvog dana programa pa sve do jagnjenja može uticati na uspeh cele operacije. Mnogi programi donose manju produktivnost i lošije rezultate zbog loše nege primaoca embriona. Embrioni se ili presadjuju ili pakuju u slamčice. Na slamčicama se beleži donor, faza razvoja i kvalitet embriona. Odgovarajući izabrani primaoci embriona se ispituju na spremnost da prihvate embrion. Ako se smatra da su materica i jajnici spremni za prihvat embriona, rog se izvlači kroz mali rez na stomaku i embrion se unosi u šupljinu materice ovce primaoca. Primalac se potom pušta na slobodu. Ultrazvučni pregled na sjagnjenost radi se 6 nedelja nakon presadjivanja, kada se potvrđuje status primaoca. Uspeh prenosa svežih embriona može da varira od 60-70%.
Zamrzavanje embriona
Pomoću posebnih medijumima, aparata i procedura, embrioni se mogu zamrznuti i čuvati u tečnom azotu. Prosečna stopa začeća sa zamrznutim embrionima kreće se od 45 do 50%.
Uvoz i izvoz embriona
Embrioni su kvalitetan, isplativi i bezbedan način širenja poželjne genetike širom sveta. Embrioni koji su obradjeni u skladu sa standardima međunarodnog društva za transfer embriona (IETS) sertifikovanih i akreditovanih praktikanata mogu biti izvezeni u razne zemlje širom sveta. Isprani embrioni po preporukama IETS-a nemaju rizik za prenos bilo koje poznate bolesti. Ispiranje spoljašnje površine embriona (zona pelucida) koji su netaknuta, sa enzimom tripsinom, obezbeđuje otklanjanje eventualnih virusnih i/ili bakterijskih uzročnika. Samo embrioni koji su obradjeni u odobrenim laboratorijama od strane osoblja za embrio transfer koji su sertifikovani i odobreni mogu se izvoziti.
Za izvoz embriona neophodni su sledeći papiri kako bi se odobrio izvoz:
- Identifikacija i sertifikacija porekla farme. 2. Period karantiniranja jedinki donora 30 dana pre i 30 dana posle ispiranja embriona. 3. Kliničko zdravlje svih donorskih životinja. 4. Pre i posle kolekcije neophodni su rezultati testova za ispitane bolesti
